I TEST DI EFFICACIA SU CRESCINA

Test clinico - Clinica Dermatologica Ospedaliera

Data: 15 luglio 1999

Studio clinico dal quale è emersa l’efficacia di Crescina come coadiuvante della crescita naturale dei capelli e come preparato capace di ridurre lo stato di diradamento del cuoio capelluto. Lo studio è stato concluso dall’équipe medica della Clinica Dermatologica presso una struttura ospedaliera pubblica, nel luglio 1999.
Lo studio è durato 6 mesi di trattamento, con 30 volontari, di cui 19 maschi e 11 femmine, di età compresa fra i 20 e i 52 anni. I maschi erano affetti da diradamento fino al V grado della scala di Hamilton, le femmine fino al III grado della scala di Ludwig. Sul lato destro del cuoio capelluto è stata applicata la lozione Crescina, sul lato sinistro una lozione Placebo.
Dopo due mesi di trattamento la clinica ha attestato una ricrescita sulla parte del cuoio capelluto trattata con Crescina: giudicata buona per 13 soggetti su 30, soddisfacente per 13 su 30, modesta per 4 su 30. Ciò significa che dopo due mesi tutti i soggetti trattati hanno avuto un risultato. Per l'86,6% il risultato è stato giudicato da soddisfacente a buono.

Dopo 4 mesi lo studio clinico ha rilevato una ricrescita giudicata:
- buona in 21 soggetti su 30
- soddisfacente in 7 soggetti su 30
- modesta in 2 soggetti su 30.

Dopo 4 mesi l'esito di ricrescita è stato confermato da soddisfacente a buono per il 93,3% dei soggetti sottoposti a trattamento.

Dopo 6 mesi i risultati sono stati i seguenti:
- ricrescita buona per 25 soggetti su 30
- ricrescita soddisfacente per 5 soggetti su 30.

Ciò significa che l'intero panel di volontari ha riscontrato risultati da soddisfacenti a buoni. Nella parte del cuoio capelluto sottoposta a placebo il risultato è stato classificato nullo o modesto.
Ma lo studio clinico non ha classificato solo gli esiti della ricrescita, bensì anche quelli connessi alla resistenza e al trofismo del capello, e allo stato del diradamento.
- Resistenza dei capelli dopo 6 mesi di trattamento: buona per 27 soggetti su 30, soddisfacente per 3 soggetti su 30.
- Trofismo dei capelli, dopo 6 mesi di trattamento: buono per 28 soggetti su 30, soddisfacente per 2 soggetti su 30.
Il riscontro sul diradamento merita un discorso a parte, perché più importante (in quanto sentito come tale dai soggetti sottoposti al test) e perché più diversificato, dal momento che i soggetti si presentavano al test con situazioni, cosiddette basali, molto diverse fra loro.

Giudizio finale complessivo espresso dal Primario Dermatologo dopo 6 mesi di trattamento in merito allo stato del diradamento: buono per 21 soggetti, soddisfacente per 9 soggetti.
Da notare che il 50% della popolazione campione aveva già migliorato lo stato di diradamento dopo soli 2 mesi di trattamento.

Test clinico-strumentale – Istituto di Ricerche Chimiche e Bioingegneria (Milano)

Data: 5 maggio 1999

Il test, il cui titolo è "Studio clinico per la valutazione dell'attività di una lozione tricologica (Crescina) in soggetti affetti da diradamento dovuto ad alopecia androgenetica e/o defluvium" è stato intrapreso su un gruppo di 25 volontari, 14 femmine e 11 maschi, di età compresa fra i 23 e i 45 anni, affetti da alopecia androgenetica di grado I-II, scala di Ludwig, per le femmine, e di grado II-III, scala di Hamilton, per i maschi e/o da defluvium, in buono stato di salute e consenzienti. Il trattamento, per scelte autonome dei volontari, è stato portato a termine da 22 dei 25 soggetti iniziali.

Test clinico-strumentale – Istituto di Ricerche Chimiche e Bioingegneria (Milano)

Data: 20 febbraio 2001.

Il test, "Studio clinico per la valutazione dell'attività di una lozione tricologica (Crescina) in soggetti affetti da diradamento dovuto ad alopecia androgenetica e/o defluvium", è stato intrapreso su un gruppo di 42 soggetti che hanno utilizzato il prodotto Crescina nell'ambito di uno studio più ampio, condotto su 84 soggetti, di confronto fra Crescina e un prodotto di riferimento utilizzato con le medesime modalità.
Applicazione: lozione applicata direttamente (ml 2,5) sul cuoio capelluto, sulle zone più diradate, frizionando leggermente fino a totale assorbimento.
In condizioni basali (T0), a due (T2) e a tre mesi (T3) è stato eseguito il fototricogramma.
Inoltre, per ciascuno dei tre tempi (0, 2, 3) è stata effettuata la ripresa fotografica di un'area alopecica.
Popolazione campione. 42 volontari/e, 24 femmine, 18 maschi. Affetti da gradi diversi di alopecia: I-II Ludwig per la femmine, II-III-IV-V Hamilton per i maschi. Ci sono stati, nel corso del trattamento, 5 drop-out. I soggetti rimasti a protocollo sono stati 37.

- Risultati del test
Fototricogramma per soggetti con diagnosi di defluvium.

- Conclusioni
Crescina è in grado di svolgere un'attività trofica, cioè di stimolo della crescita dei capelli in soggetti affetti da diradamento di varia natura.
Nei soggetti con diagnosi di defluvium: miglioramento dopo due mesi di trattamento.
Nei soggetti con diagnosi di alopecia: incremento del numero di capelli in fase anagen rispetto a quelli in fase telogen/catagen. Effetto evidenziato sia per le femmine che per i maschi.

ESEMPI DI FOTO TRATTE DAI TEST

STUDIO CLINICO PER LA VALUTAZIONE DELL'ATTIVITA' DI UNA LOZIONE TRICOLOGICA IN SOGGETTI AFFETTI DA DIRADAMENTO DOVUTO AD ALOPECIA ANDROGENETICA E/O DEFLUVIUM - ISTITUTO DI RICERCHE CLINICHE E BIOINGEGNERIA.
RIPRESE FOTOGRAFICHE RELATIVE ALLA CONTA ELETTRONICA DEL NUMERO DI CAPELLI

ESEMPI DI FOTO TRATTE DAI TEST

STUDIO CLINICO PER LA VALUTAZIONE DELL'ATTIVITA' DI UNA LOZIONE TRICOLOGICA IN SOGGETTI AFFETTI DA DIRADAMENTO DOVUTO AD ALOPECIA ANDROGENETICA E/O DEFLUVIUM - ISTITUTO DI RICERCHE CLINICHE E BIOINGEGNERIA.
RIPRESE FOTOGRAFICHE DI UN'AREA ALOPECICA (LINEA DI INSERZIONE DEI CAPELLI IN REGIONE FRONTO-TEMPORALE DESTRA)

"IN VITRO" TEST

Effects of Crescina® on human primary epidermal and dermal cells -
Investigators: V C Biotechnology

Aim of project
It has been tested a preparation formed by the nucleus of Crescina hair treatment active principles in an aqueous solution and with the following composition: aqua, glycerin, lysine hydrochloride, acetyl cysteine, glycoproteins.

The objectives of this project were the following:

Objective 1
We investigated effects of Crescina on human primary keratinocytes and fibroblast cell proliferation

Objective 2
We investigated the effects of Crescina on protein synthesis in human in primary human keratinocytes and fibroblasts.

Abbreviations used
NHEK: Normal human epidermal keratinocytes
NHDF: Normal human dermal fibroblasts
SD: Standard deviation
MV: Mean value

Study protocol

Objective 1

Cell Cultures. Primary human keratinocytes and fibroblasts were obtained from Promocell (Heidelberg, Germany). Cells were maintained in specific growth medium supplemented with growth factors and seeded in 96 well plates (10 000 cells/well) for determination of cell proliferation and in 24 well plates for protein synthesis. Cells were treated for different period of time (24, 48 and 72 hours) with increasing concentrations (0.031, 0.062, 0.125, 0.25, 0.5% w/v = 310 µg/ml, 620.5 µg/ml, 1.25 mg/ml, 2.5 mg/ml, 5 mg/ml provided as 0.31 µl, 0.62 µl, 1.25 µl, 2.5 µl, 5 µl) of a solution of Crescina. Medium was removed before stimulation and replaced by fresh medium without growth factors. The growth factor supplements, as well as the growth factors PDGF (platelet derived growth factor) and FGF (fibroblast growth factor), were used as positive controls. Not-treated cells have been used as negative control.

Determination of cell proliferation.
Fibroblasts or keratinocytes were incubated with Crescina for 24 h, 48 h, and 72h. Each dose (see above) was tested 16 times (8 wells on 2 plates with two different methods).
Proliferation of primary fibroblasts/keratinocytes was determined by:

Determination of protein content.
Human primary keratinocytes or fibroblasts from human skin origin were seeded in 24 or 6 well plates and incubated with the Crescina (5 doses see above) for different times (24, 48 and 72 hours) with n = 4. After cell treatment, cells will be washed with phosphate buffered saline (PBS) and lysed in 1.3 x SDS (sodium dodecyl sulfate)-containing sample buffer without DTT containing 100 µM orthovanadate (Laemmli, 1970). Lysates will be homogenized by repeated passage through a 26-gauge-needle. Protein contents will be measured using the bicinchoninic acid method (BCA protein determination kit from Pierce, distributed by KFC Chemikalien, München, Germany) according to the manufacturer’s instructions (standards (bovine serum albumine, Sigma) ranging form 0.2 µg/µl to 4 µg/µl; optical density read at 570 nm). This method is a well established method to determine protein content and was part of at least 20 high impact publications from our group (e.g. Akundi et al., 2004).

Deviations:
To obtain more valid data in fibroblasts, additional experiments were performed using less cell numbers (1 000 and 5 000), and two additional time points.

Results and Discussion

Determination of cell proliferation.
On human keratinocytes experiments, at all tested time points 24, 48 and 72 h, Crescina had no effect on DNA synthesis as measured by dBrdU incorporation.
In contrast, Crescina revealed to increase the reaction of AlamarBlue. This effect was significant, suggesting that Crescina has an effect on cell viability (underlining values > 100% of metabolic activity) compared to non-treated cells (negative control) which cell vitality was considered as 100%. The effects were especially evident with 0.5% of the product Crescina with a maximum value of + 55% at 24 h (Fig. 4) and with 0.25% of the product Crescina with maximum values of + 56.3% at 48 h (Fig. 5) and + 61.6% at 72 h. Furthermore, our data suggest, that Crescina increases the metabolic activity of cells by increasing cellular energy levels.

At all tested time points fibroblastic DNA synthesis was not affected by Crescina, even if it’s possible to notice a quite moderate effect on DNA synthesis as measured by dBrdU incorporation (maximum value + 5.1% with 0.25% of the product Crescina after 48 h) in comparison with non-treated cells.
In the fibroblast experiments using the AlamarBlue method, additional experiments were performed using an inferior number of cells (1 000 and 5 000 cells/well) and two additional time points (4 and 6 h) just to obtain data of major validity. The use of 10 000 cells as starting point did not gain significant data since the fibroblasts are rapid proliferating cells and therefore cell proliferation and metabolism was probably maximal and not further increasable with this amount of cells suggesting that cell metabolism was already decreased due to cell to cell interaction lowering the proliferation rate of the cells.
In the AlamarBlue assays with 1 000 cells/well, Crescina showed a quite moderate increase of metabolic activity, compared to the negative control, after 4 and 6 h with maximal values of + 14.5 % and + 20.5% respectively, both with 0.5% of Crescina.
Very potent effects were obtained after 24, 48, and 72 h (Figs. 13-14) with maximal increase in the metabolic activity of + 58.5% with 0.125% of Crescina at 24 h, + 111.4% with 0.25% of Crescina at 48 h and + 195.7% with 0.5% of Crescina at 72 h, compared to negative control.
Furthermore, in the AlamarBlue assays determining the Crescina effects on cell proliferation with 5 000 cells/well, Crescina showed an increase in the metabolic activity, compared to non-treated cells (negative control), 4 and 6 h with maximal values of + 33.1% and + 36.5% both with 0.5% of Crescina.
Very potent effects were detected after 24, 48, and 72 h (Figs. 18-19) showing an increase in metabolic activity of + 80.3% with 0.0625% of Crescina at 24 h, + 119.3% with 0.5% of Crescina at 48 h, and + 91.4% with 0.5% of Crescina at 72 h, all of them compared to negative control.
In this way, Crescina increased AlamarBlue reactivity when 5 000 cells were seeded but not as potent as with 1 000 cells per well.
Only slight effects were visible after 24 h, when 10 000 cells where seeded (+ 20.2% with 0.5% of Crescina), and no effects after 48 and 72 h (Fig. 20), suggesting that the proliferation and the viability of cells is not further increasable after later time points. This indicated, that the number of cells is critical for obtaining effects of Crescina and that the number of 10 000 cells is to high to induce cell viability by possible cell to cell interactions occurring in confluent cell layers.

Determination of protein content.
Determination of protein content performed using keratinocytes revealed that, compared to non-treated cells, Crescina increased protein content (+ 160.3%) at the dose of 0.125% of Crescina at 24 h, at the doses of 0.0625% (+ 242.1%) and 0,125% (+ 206.8%) after 48 h and, at least, after 72 h with 0.25% of Crescina it’s possible to notice an increase of protein content of + 73.9% (Fig. 23, 24).
No increase in protein content was visible in fibroblasts after 24 h, but a slight increasing effect after 72 h: + 51.4% with the exposition at 0.125% of Crescina.

Conclusions

Determination of cell proliferation.
Using human keratinocytes, the preparation Crescina had no effects on DNA synthesis as measured by dBrdU incorporation at all tested time points 24, 48 and 72 h.
However, Crescina increased the metabolic activity of cells by increasing cellular energy levels as revealed by the reaction of AlamarBlue.
Using human fibroblasts, Crescina had no effect on DNA synthesis as measured by dBrdU incorporation at all tested time points 24, 48 and 72 h.
In the AlamarBlue assays, very potent effects were obtained after 24, 48, and 72 h with an increase in the metabolic activity compared to non-treated cells .
Our data suggest that due to its positive effects on cell viability and metabolism as shown by the AlamarBlue assays, Crescina should also increase the cell number. Furthermore, we conclude that the treatment with Crescina increases cell life, finally resulting in increased cell numbers, if compared to untreated cells, which have a more rapid cell turnover. This increase in cell numbers in Crescina treated cells, will not increase DNA synthesis as observed in this study.

Determination of protein content.
Determination of protein content in keratinocytes revealed that Crescina increased protein content considerably after 24 h (+ 160.3%) and 48 h (+ 242.1%) compared to negative control.
In fibroblasts, a slight increasing effect was visible after 72 h (+ 51.4%) compared to non-treated cells.
The difference in the total protein content between keratinocytes and fibroblasts is due to the differences in the total cell volume between the epithelial keratinocytes and the smaller fibroblasts.
Therefore, the protein content has not increased in consequence of the pro-proliferative effect of Crescina, but it might be increased due to increased cell viability. This fits to the hypothesis that Crescina promotes cellular metabolism.

Finally, we demonstrated that preparation Crescina increased cell metabolism and therefore might act as a cell protective and energizing hair treatment.

Figures

LE CONFERME SULL’EFFICACIA DI CRESCINA

Labo ha ritenuto corretto e opportuno, per la propria ricerca, la pubblicità, la politica commerciale, interpellare il mercato per conoscere l'opinione di clientela primaria – i farmacisti – e finale – i consumatori – sulla qualità del prodotto e sulla loro soddisfazione. I risultati delle inchieste sono stati eccezionalmente positivi.

A) Testimonianze di efficacia dei farmacisti

Labo ha raccolto testimonianze dirette dei farmacisti sulla qualità del prodotto Crescina e sulla soddisfazione della clientela. Il campione è significativo: 497 farmacie distribuite su tutto il territorio nazionale.
Le farmacie interpellate hanno timbrato e sottoscritto un questionario così concepito: