LES TESTS D'EFFICACITÉ SUR CRESCINA

Test clinique - Clinique Dermatologique

Date: 15 juillet 1999

Étude clinique soulignant l'efficacité de Crescina comme adjuvant de la pousse naturelle des cheveux et comme préparation en mesure de réduire l'état d'éclaircissement du cuir chevelu. L'étude a été conclue par l'équipe médicale de la Clinique Dermatologique auprès d’une Maison de Santé publique, en juillet 1999.
Cette étude consistait en un traitement d'une durée de 6 mois, avec 30 volontaires, dont 19 hommes et 11 femmes âgés de 20 à 52 ans. Les volontaires présentaient un éclaircissement équivalant au degré V de l'échelle de Hamilton pour les hommes et au degré III de l'échelle de Ludwig pour les femmes. La lotion Crescina a été appliquée sur le côté droit du cuir chevelu et la lotion placebo sur le côté gauche.
Après deux mois de traitement, la clinique a attesté une repousse sur la partie du cuir chevelu traitée avec Crescina: jugée bonne chez 13 sujets sur 30, satisfaisante chez 13 sujets sur 30 et modeste chez 4 sujets sur 30. Ces chiffres signifient donc que tous les sujets traités ont obtenu un résultat au bout de deux mois. Dans 86,6% des cas le résultat a été jugé de satisfaisant à bon.

Au bout de 4 mois, l'étude clinique a observé une repousse jugée:
- bonne chez 21 sujets sur 30
- satisfaisante chez 7 sujets sur 30
- modeste chez 2 sujets sur 30.

Au bout de 4 mois, le résultat de repousse a été confirmé de satisfaisant à bon pour 93,3% des sujets soumis au traitement.

Au bout de 6 mois les résultats ont été les suivants:
- bonne repousse chez 25 sujets sur 30
- repousse satisfaisante chez 5 sujets sur 30.

Ces données indiquent que tout le panel de volontaires a obtenu des résultats de satisfaisants à bons. Le résultat obtenu sur la partie du cuir chevelu soumise à un placebo a été jugé nul ou modeste. L'étude clinique n'a cependant pas classifié que les résultats de la repousse, mais également ceux liés à la résistance et au trophisme du cheveu ainsi qu'au degré d’éclaircissement.
- Résistance des cheveux au bout de 6 mois de traitement: bonne chez 27 sujets sur 30 et satisfaisante chez 3 sujets sur 30.
- Trophisme des cheveux au bout de 3 mois de traitement: bon chez 28 sujets sur 30 et satisfaisant chez 2 sujets sur 30.
Le résultat concernant l’éclaircissement mérite un discours à part étant donné qu'il est plus important (tel est l'avis des sujets soumis au test) et plus diversifié car les sujets se présentaient au test avec des situations, dénommées basales, très différentes les unes des autres.

Jugement final global exprimé par le Médecin Dermatologue-chef au bout de 6 mois de traitement au sujet du degré d'éclaircissement: bon chez 21 sujets, satisfaisant chez 9 sujets.
À noter que 50% de la population-échantillon avait déjà amélioré le degré d'éclaircissement au bout de 2 mois de traitement.

Test clinique et instrumental - Institut de Recherches Chimiques et Bio-ingénierie (Milan)

Date: 5 mai 1999

Le test, intitulé “Étude clinique pour l'évaluation de l’activité d'une lotion trichologique (Crescina) chez des sujets présentant un état d'éclaircissement des cheveux dû à une alopécie androgénétique et/ou un defluvium capillorum” a été menée sur un groupe de 25 volontaires, 14 femmes et 11 hommes, âgés de 23 à 45 ans, atteints d'une alopécie androgénétique d'un degré I-II sur l'échelle de Ludwig pour les femmes et d'un degré II-III sur l'échelle de Hamilton pour les hommes et/ou d'un defluvium capillorum, en bon état de santé et consentants. Le traitement, pour des choix autonomes de la part des volontaires, a été suivi jusqu'à la fin par 22 sujets sur 25.

Test clinique et instrumental - Institut de Recherches Chimiques et Bio-ingénierie (Milan)

Date: 20 février 2001.

Le test, “Étude clinique pour l'évaluation de l'activité d'une lotion trichologique (Crescina) sur des sujets présentant un éclaircissement dû à une alopécie androgénétique et/ou un defluvium capillorum”, a été réalisé sur un groupe de 42 sujets qui ont utilisé le produit Crescina dans le cadre d'une plus vaste étude, menée sur 84 sujets, prévoyant la confrontation entre Crescina et un produit de référence utilisé selon les mêmes modalités.
Application: lotion appliquée directement (ml 2,5) sur le cuir chevelu, sur les zones plus clairsemées, en frictionnant légèrement jusqu'à absorption totale.
Dans des conditions basales (T0), à deux (T2) et à trois mois (T3) a été effectué le phototrichogramme.
Une zone alopécique a de plus été photographiée pour chacun des trois temps (0, 2, 3).
Population-échantillon. 42 volontaires, 24 femmes, 18 hommes. Atteints d'une alopécie à différents stades: I-II Ludwig pour les femmes, II-III-IV-V Hamilton pour les hommes. Au cours du traitement, 5 sujets ont abandonné.
Les sujets ayant suivi le protocole ont été au nombre de 37.

- Résultats du test
Phototrichogramme pour des sujets chez qui a été diagnostiqué un defluvium capillorum.

- Conclusions
Crescina est en mesure d'exercer une action trophique, c'est-à-dire de stimuler la pousse des cheveux chez des sujets présentant un éclaircissement de nature diverse.
Sujets chez lesquels a été diagnostiqué un defluvium capillorum: amélioration au bout de deux mois de traitement.
Sujets chez lesquels a été diagnostiquée une alopécie: augmentation du nombre de cheveux en phase anagène par rapport à ceux de la phase télogène/catagène. Effet souligné aussi bien chez les femmes que chez les hommes.

EXEMPLES DE PHOTOS TIRÉES DES TESTS

ÉTUDE CLINIQUE POUR L'ÉVALUATION DE L'ACTIVITÉ D'UNE LOTION TRICHOLOGIQUE SUR DES SUJETS PRÉSENTANT UN ÉCLAIRCISSEMENT DÛ À UNE ALOPÉCIE ANDROGÉNÉTIQUE ET/OU UN DEFLUVIUM CAPILLORUM - INSTITUT DE RECHERCHES CLINIQUES ET BIO-INGÉNIERIE.
PHOTOGRAPHIES RELATIVES AU COMPTAGE ÉLECTRONIQUE DU NOMBRE DE CHEVEUX

EXEMPLES DE PHOTOS TIRÉES DES TESTS

ÉTUDE CLINIQUE POUR L'ÉVALUATION DE L'ACTIVITÉ D'UNE LOTION TRICHOLOGIQUE SUR DES SUJETS PRÉSENTANT UN ÉCLAIRCISSEMENT DÛ À UNE ALOPÉCIE ANDROGÉNÉTIQUE ET/OU UN DEFLUVIUM CAPILLORUM - INSTITUT DE RECHERCHES CLINIQUES ET BIO-INGÉNIERIE.
PHOTOGRAPHIES D'UNE ZONE ALOPÉCIQUE (LIGNE D'INSERTION DES CHEVEUX DANS LA RÉGION FRONTO-TEMPORALE DROITE)

"IN VITRO" TEST

Effects of Crescina® on human primary epidermal and dermal cells -
Investigators: V C Biotechnology

Aim of project
It has been tested a preparation formed by the nucleus of Crescina hair treatment active principles in an aqueous solution and with the following composition: aqua, glycerin, lysine hydrochloride, acetyl cysteine, glycoproteins.

The objectives of this project were the following:

Objective 1
We investigated effects of Crescina on human primary keratinocytes and fibroblast cell proliferation

Objective 2
We investigated the effects of Crescina on protein synthesis in human in primary human keratinocytes and fibroblasts.

Abbreviations used
NHEK: Normal human epidermal keratinocytes
NHDF: Normal human dermal fibroblasts
SD: Standard deviation
MV: Mean value

Study protocol

Objective 1

Cell Cultures. Primary human keratinocytes and fibroblasts were obtained from Promocell (Heidelberg, Germany). Cells were maintained in specific growth medium supplemented with growth factors and seeded in 96 well plates (10 000 cells/well) for determination of cell proliferation and in 24 well plates for protein synthesis. Cells were treated for different period of time (24, 48 and 72 hours) with increasing concentrations (0.031, 0.062, 0.125, 0.25, 0.5% w/v = 310 µg/ml, 620.5 µg/ml, 1.25 mg/ml, 2.5 mg/ml, 5 mg/ml provided as 0.31 µl, 0.62 µl, 1.25 µl, 2.5 µl, 5 µl) of a solution of Crescina. Medium was removed before stimulation and replaced by fresh medium without growth factors. The growth factor supplements, as well as the growth factors PDGF (platelet derived growth factor) and FGF (fibroblast growth factor), were used as positive controls. Not-treated cells have been used as negative control.

Determination of cell proliferation.
Fibroblasts or keratinocytes were incubated with Crescina for 24 h, 48 h, and 72h. Each dose (see above) was tested 16 times (8 wells on 2 plates with two different methods).
Proliferation of primary fibroblasts/keratinocytes was determined by:

Determination of protein content.
Human primary keratinocytes or fibroblasts from human skin origin were seeded in 24 or 6 well plates and incubated with the Crescina (5 doses see above) for different times (24, 48 and 72 hours) with n = 4. After cell treatment, cells will be washed with phosphate buffered saline (PBS) and lysed in 1.3 x SDS (sodium dodecyl sulfate)-containing sample buffer without DTT containing 100 µM orthovanadate (Laemmli, 1970). Lysates will be homogenized by repeated passage through a 26-gauge-needle. Protein contents will be measured using the bicinchoninic acid method (BCA protein determination kit from Pierce, distributed by KFC Chemikalien, München, Germany) according to the manufacturer’s instructions (standards (bovine serum albumine, Sigma) ranging form 0.2 µg/µl to 4 µg/µl; optical density read at 570 nm). This method is a well established method to determine protein content and was part of at least 20 high impact publications from our group (e.g. Akundi et al., 2004).

Deviations:
To obtain more valid data in fibroblasts, additional experiments were performed using less cell numbers (1 000 and 5 000), and two additional time points.

Results and Discussion

Determination of cell proliferation.
On human keratinocytes experiments, at all tested time points 24, 48 and 72 h, Crescina had no effect on DNA synthesis as measured by dBrdU incorporation.
In contrast, Crescina revealed to increase the reaction of AlamarBlue. This effect was significant, suggesting that Crescina has an effect on cell viability (underlining values > 100% of metabolic activity) compared to non-treated cells (negative control) which cell vitality was considered as 100%. The effects were especially evident with 0.5% of the product Crescina with a maximum value of + 55% at 24 h (Fig. 4) and with 0.25% of the product Crescina with maximum values of + 56.3% at 48 h (Fig. 5) and + 61.6% at 72 h. Furthermore, our data suggest, that Crescina increases the metabolic activity of cells by increasing cellular energy levels.

At all tested time points fibroblastic DNA synthesis was not affected by Crescina, even if it’s possible to notice a quite moderate effect on DNA synthesis as measured by dBrdU incorporation (maximum value + 5.1% with 0.25% of the product Crescina after 48 h) in comparison with non-treated cells.
In the fibroblast experiments using the AlamarBlue method, additional experiments were performed using an inferior number of cells (1 000 and 5 000 cells/well) and two additional time points (4 and 6 h) just to obtain data of major validity. The use of 10 000 cells as starting point did not gain significant data since the fibroblasts are rapid proliferating cells and therefore cell proliferation and metabolism was probably maximal and not further increasable with this amount of cells suggesting that cell metabolism was already decreased due to cell to cell interaction lowering the proliferation rate of the cells.
In the AlamarBlue assays with 1 000 cells/well, Crescina showed a quite moderate increase of metabolic activity, compared to the negative control, after 4 and 6 h with maximal values of + 14.5 % and + 20.5% respectively, both with 0.5% of Crescina.
Very potent effects were obtained after 24, 48, and 72 h (Figs. 13-14) with maximal increase in the metabolic activity of + 58.5% with 0.125% of Crescina at 24 h, + 111.4% with 0.25% of Crescina at 48 h and + 195.7% with 0.5% of Crescina at 72 h, compared to negative control.
Furthermore, in the AlamarBlue assays determining the Crescina effects on cell proliferation with 5 000 cells/well, Crescina showed an increase in the metabolic activity, compared to non-treated cells (negative control), 4 and 6 h with maximal values of + 33.1% and + 36.5% both with 0.5% of Crescina.
Very potent effects were detected after 24, 48, and 72 h (Figs. 18-19) showing an increase in metabolic activity of + 80.3% with 0.0625% of Crescina at 24 h, + 119.3% with 0.5% of Crescina at 48 h, and + 91.4% with 0.5% of Crescina at 72 h, all of them compared to negative control.
In this way, Crescina increased AlamarBlue reactivity when 5 000 cells were seeded but not as potent as with 1 000 cells per well.
Only slight effects were visible after 24 h, when 10 000 cells where seeded (+ 20.2% with 0.5% of Crescina), and no effects after 48 and 72 h (Fig. 20), suggesting that the proliferation and the viability of cells is not further increasable after later time points. This indicated, that the number of cells is critical for obtaining effects of Crescina and that the number of 10 000 cells is to high to induce cell viability by possible cell to cell interactions occurring in confluent cell layers.

Determination of protein content.
Determination of protein content performed using keratinocytes revealed that, compared to non-treated cells, Crescina increased protein content (+ 160.3%) at the dose of 0.125% of Crescina at 24 h, at the doses of 0.0625% (+ 242.1%) and 0,125% (+ 206.8%) after 48 h and, at least, after 72 h with 0.25% of Crescina it’s possible to notice an increase of protein content of + 73.9% (Fig. 23, 24).
No increase in protein content was visible in fibroblasts after 24 h, but a slight increasing effect after 72 h: + 51.4% with the exposition at 0.125% of Crescina.

Conclusions

Determination of cell proliferation.
Using human keratinocytes, the preparation Crescina had no effects on DNA synthesis as measured by dBrdU incorporation at all tested time points 24, 48 and 72 h.
However, Crescina increased the metabolic activity of cells by increasing cellular energy levels as revealed by the reaction of AlamarBlue.
Using human fibroblasts, Crescina had no effect on DNA synthesis as measured by dBrdU incorporation at all tested time points 24, 48 and 72 h.
In the AlamarBlue assays, very potent effects were obtained after 24, 48, and 72 h with an increase in the metabolic activity compared to non-treated cells .
Our data suggest that due to its positive effects on cell viability and metabolism as shown by the AlamarBlue assays, Crescina should also increase the cell number. Furthermore, we conclude that the treatment with Crescina increases cell life, finally resulting in increased cell numbers, if compared to untreated cells, which have a more rapid cell turnover. This increase in cell numbers in Crescina treated cells, will not increase DNA synthesis as observed in this study.

Determination of protein content.
Determination of protein content in keratinocytes revealed that Crescina increased protein content considerably after 24 h (+ 160.3%) and 48 h (+ 242.1%) compared to negative control.
In fibroblasts, a slight increasing effect was visible after 72 h (+ 51.4%) compared to non-treated cells.
The difference in the total protein content between keratinocytes and fibroblasts is due to the differences in the total cell volume between the epithelial keratinocytes and the smaller fibroblasts.
Therefore, the protein content has not increased in consequence of the pro-proliferative effect of Crescina, but it might be increased due to increased cell viability. This fits to the hypothesis that Crescina promotes cellular metabolism.

Finally, we demonstrated that preparation Crescina increased cell metabolism and therefore might act as a cell protective and energizing hair treatment.

Figures

LES CONFIRMATIONS SUR L’EFFICACITÉ DE CRESCINA

La société Labo a jugé correct et opportun, pour sa propre recherche, pour la publicité et la politique commerciale, de consulter le marché afin de connaître l'opinion de la clientèle primaire – les pharmaciens – et finale – les consommateurs – sur la qualité du produit et sur leur satisfaction. Les résultats des sondages se sont révélés exceptionnellement positifs.

A) Témoignages d'efficacité de la part des pharmaciens

La société Labo a recueilli des témoignages directs de la part des pharmaciens quant à la qualité du produit Crescina et la satisfaction de la clientèle. L'échantillon est significatif: 497 pharmacies distribuées sur tout le territoire national.
Les pharmacies contactées ont timbré et signé un questionnaire conçu de la manière suivante: