TESTY SKUTECZNOŚCI CRESCINA

Testy kliniczne przeprowadzone w klinice dermatologicznej.

Data: 15 lipca 1999

Badanie kliniczne, które wykazało, że Crescina wspomaga naturalny wzrost włosów oraz pomaga walczyć z przerzedzaniem włosów. Badania były przeprowadzone przez zespół lekarzy w Klinice Dermatologii w Szpitalu Publicznym w lipcu 1999. Badanie trwało 6 miesięcy i uczestniczyło w nim trzydziestu ochotników, 19 mężczyzn oraz 11 kobiet, w wieku od 20 do 52 lat. Mężczyźni cierpieli na przerzedzanie włosów do poziomu V w skali Hamiltona, a kobiety do poziomu III w skali Ludwiga. Na prawą stronę skóry głowy nałożono preparat Crescina, a na lewą stronę - placebo. Po 2 miesiącach badania, klinika zaobserwowała odrastanie po tej stronie skóry głowy, na którą nałożono Crescina i stwierdzono, że: dla 13 badanych na 30 - odrastanie określono jako dobre, dla 13 badanych na 30 - jako zadowalające, dla 4 na 30 - jako średnie. Oznacza to, że w ciągu 2 miesięcy u badanych stwierdzono pewne wyniki: 86,6% oceniło wyniki jako zadowalające do dobrych.

Po czterech miesiącach badania kliniczne wykazały, że odrastanie można określić jako:
- dobre u 21 badanych na 30
- zadowalające u 7 badanych na 30
- średnie u 2 badanych na 30.

Po czterech miesiącach odrastanie włosów zostało określone jako zadowalające do dobrego u 93,3% badanych.
Po sześciu miesiącach osiągnięto następujące wyniki:
- odrastanie włosów ocenione jako dobre u 25 badanych na 30
- zadowalające u 5 badanych na 30
Oznacza to, że w całej grupie ochotników  osiągnięto wyniki określane jako zadowalające do dobrych. W części skóry głowy, na którą nałożono placebo, wyniki oceniono jako żadne lub średnie. Jednakże, badania kliniczne nie tylko klasyfikowały wyniki odrastania włosów, lecz również zajmowały się wzmocnieniem włosa, jego odżywianiem, a także stopniem przerzedzenia.
- Wytrzymałość włosów po 6 miesiącach pielęgnacji: dobra u 27 badanych na 30, zadowalająca u 3 badanych na 30.
- Odżywienie włosa po 6 miesiącach pielęgnacji: dobra u 28 badanych na 30, zadowalająca u 2 badanych na 30.
Informacje zwrotne dotyczące przerzedzania powinny być omówione oddzielnie, ponieważ są one bardzo ważne (wg opinii badanych), a także ponieważ były bardziej zróżnicowane, co wynikało również z podstawowego faktu, że sytuacja badanych w momencie, kiedy przystąpili do badań była inna w każdym przypadku.

Ostateczna opinia ogólna ordynatora dermatologii po 6 miesiącach pielęgnacji o stanie przerzedzenia: wynik dobry u 21 badanych, zadowalający u 9 badanych.
Należy również zauważyć, że u 50% populacji uczestniczącej w próbie poprawę stwierdzono już po 2 miesiącach.

Badanie przy pomocy przyrządów oraz badanie kliniczne w  Instytucie Badań Chemicznych i Bioinżynierii, Mediolan

Data: 5 maja 1999

Badanie pt. “Badania kliniczne w celu oceny działania preparatu trychologicznego  (Crescina) u osób cierpiących na przerzedzenie włosów  wynikające z łysienia androgenetycznego oraz / lub wypadania włosów” zostało przeprowadzone na grupie 25 zdrowych ochotników, 14 kobiet i 11 mężczyzn, w wieku od 23 do 45, dotkniętych łysieniem androgenetycznym oraz/lub wypadaniem włosów - poziom I-II wg skali Ludwiga, w przypadku kobiet, oraz poziom II-III wg skali Hamiltona w przypadku mężczyzn. Pielęgnację, wg woli badanych, ukończyło 22 z 25 początkowych ochotników.

Badania przy pomocy przyrządów oraz badania kliniczne w Instytucie Badań Chemicznych i Bioinżynierii, Mediolan

Data: 20 lutego 2001.

Badanie pt. “Badania kliniczne w celu oceny działania preparatu trychologicznego (Crescina) u osób cierpiących na przerzedzenie włosów wynikające z łysienia androgenetycznego oraz/ lub wypadania włosów” zostało przeprowadzone na grupie 42 zdrowych ochotników, stosujących preparat Crescina w ramach szerszego studium dotyczącego 84 badanych, co pozwoliło porównać Crescina oraz produkt referencyjny  stosowany w taki sam sposób.
Stosowanie: preparat nakłada się bezpośrednio (2,5 ml) na skórę głowy, na obszar, w którym przerzedzenie jest największe, a następnie wmasowuje się aż do całkowitej absorpcji.
Na początku (T0), po dwóch (T2) oraz trzech miesiącach (T3), wykonano fototrichogram.
Dodatkowo, dla każdego z tych trzech okresów (0, 2, 3) obszar łysienia został sfotografowany.
Taka sama populacja 42 ochotników: 24 kobiety, 18 mężczyzn. Osoby cierpiące na różne stopnie łysienia: I-II wg skali Ludwiga w przypadku kobiet, II-III-IV-V wg skali Hamiltona w przypadku mężczyzn. 5 ochotników przerwało cykl pielęgnacji.
37 badanych wypełniło protokół.

- Wyniki badania
Fototrichogram dla badanych, u których zdiagnozowano wypadanie włosów.

- Wnioski
Crescina jest zdolna do działania troficznego, co oznacza, że stymuluje ona wzrost włosa u osób cierpiących na przerzedzenie włosów z różnych przyczyn.
U osób z diagnozą wypadania włosów: poprawa po 2 miesiącach pielęgnacji.
U osób z diagnozą łysienia: zwiększenie ilości włosów w fazie anagenowej w porównaniu do włosów w fazie telogenowej/katagenowej. Zauważalne efekty zarówno u kobiet, jak i u mężczyzn.

PRZYKŁADY ZDJĘĆ WYKONANYCH PODCZAS BADAŃ

BADANIA KLINICZNE W CELU OCENY DZIAŁANIA PREPARATU TRYCHOLOGICZNEGO U OSÓB CIERPIĄCYCH NA PRZERZEDZENIE WŁOSÓW WYNIKAJĄCE Z ŁYSIENIA ANDROGENETYCZNEGO ORAZ/LUB WYPADANIA WŁOSÓW - INSTYTUT BADAŃ KLINICZNYCH ORAZ BIOINŻYNIERII.
ZDJĘCIA DO ELEKTRONICZNEGO OBLICZANIAWŁOSÓW.

PRZYKŁADY ZDJĘĆ WYKONANYCH PODCZAS BADAŃ

BADANIA KLINICZNE W CELU OCENY DZIAŁANIA PREPARATU TRYCHOLOGICZNEGO U OSÓB CIERPIĄCYCH NA PRZERZEDZENIE WŁOSÓW WYNIKAJĄCE Z ŁYSIENIA ANDROGENETYCZNEGO ORAZ / LUB WYPADANIA WŁOSÓW -INSTYTUT BADAŃ KLINICZNYCH ORAZ BIOINŻYNIERII.
ZDJĘCIA OBSZARU ŁYSIENIA (LINIA WŁOSÓW Z PRAWEJ STRONY CZOŁA, OKOLICE SKRONI)

"IN VITRO" TEST

Effects of Crescina® on human primary epidermal and dermal cells -
Investigators: V C Biotechnology

Aim of project
It has been tested a preparation formed by the nucleus of Crescina hair treatment active principles in an aqueous solution and with the following composition: aqua, glycerin, lysine hydrochloride, acetyl cysteine, glycoproteins.

The objectives of this project were the following:

Objective 1
We investigated effects of Crescina on human primary keratinocytes and fibroblast cell proliferation

Objective 2
We investigated the effects of Crescina on protein synthesis in human in primary human keratinocytes and fibroblasts.

Abbreviations used
NHEK: Normal human epidermal keratinocytes
NHDF: Normal human dermal fibroblasts
SD: Standard deviation
MV: Mean value

Study protocol

Objective 1

Cell Cultures. Primary human keratinocytes and fibroblasts were obtained from Promocell (Heidelberg, Germany). Cells were maintained in specific growth medium supplemented with growth factors and seeded in 96 well plates (10 000 cells/well) for determination of cell proliferation and in 24 well plates for protein synthesis. Cells were treated for different period of time (24, 48 and 72 hours) with increasing concentrations (0.031, 0.062, 0.125, 0.25, 0.5% w/v = 310 µg/ml, 620.5 µg/ml, 1.25 mg/ml, 2.5 mg/ml, 5 mg/ml provided as 0.31 µl, 0.62 µl, 1.25 µl, 2.5 µl, 5 µl) of a solution of Crescina. Medium was removed before stimulation and replaced by fresh medium without growth factors. The growth factor supplements, as well as the growth factors PDGF (platelet derived growth factor) and FGF (fibroblast growth factor), were used as positive controls. Not-treated cells have been used as negative control.

Determination of cell proliferation.
Fibroblasts or keratinocytes were incubated with Crescina for 24 h, 48 h, and 72h. Each dose (see above) was tested 16 times (8 wells on 2 plates with two different methods).
Proliferation of primary fibroblasts/keratinocytes was determined by:

Determination of protein content.
Human primary keratinocytes or fibroblasts from human skin origin were seeded in 24 or 6 well plates and incubated with the Crescina (5 doses see above) for different times (24, 48 and 72 hours) with n = 4. After cell treatment, cells will be washed with phosphate buffered saline (PBS) and lysed in 1.3 x SDS (sodium dodecyl sulfate)-containing sample buffer without DTT containing 100 µM orthovanadate (Laemmli, 1970). Lysates will be homogenized by repeated passage through a 26-gauge-needle. Protein contents will be measured using the bicinchoninic acid method (BCA protein determination kit from Pierce, distributed by KFC Chemikalien, München, Germany) according to the manufacturer’s instructions (standards (bovine serum albumine, Sigma) ranging form 0.2 µg/µl to 4 µg/µl; optical density read at 570 nm). This method is a well established method to determine protein content and was part of at least 20 high impact publications from our group (e.g. Akundi et al., 2004).

Deviations:
To obtain more valid data in fibroblasts, additional experiments were performed using less cell numbers (1 000 and 5 000), and two additional time points.

Results and Discussion

Determination of cell proliferation.
On human keratinocytes experiments, at all tested time points 24, 48 and 72 h, Crescina had no effect on DNA synthesis as measured by dBrdU incorporation.
In contrast, Crescina revealed to increase the reaction of AlamarBlue. This effect was significant, suggesting that Crescina has an effect on cell viability (underlining values > 100% of metabolic activity) compared to non-treated cells (negative control) which cell vitality was considered as 100%. The effects were especially evident with 0.5% of the product Crescina with a maximum value of + 55% at 24 h (Fig. 4) and with 0.25% of the product Crescina with maximum values of + 56.3% at 48 h (Fig. 5) and + 61.6% at 72 h. Furthermore, our data suggest, that Crescina increases the metabolic activity of cells by increasing cellular energy levels.

At all tested time points fibroblastic DNA synthesis was not affected by Crescina, even if it’s possible to notice a quite moderate effect on DNA synthesis as measured by dBrdU incorporation (maximum value + 5.1% with 0.25% of the product Crescina after 48 h) in comparison with non-treated cells.
In the fibroblast experiments using the AlamarBlue method, additional experiments were performed using an inferior number of cells (1 000 and 5 000 cells/well) and two additional time points (4 and 6 h) just to obtain data of major validity. The use of 10 000 cells as starting point did not gain significant data since the fibroblasts are rapid proliferating cells and therefore cell proliferation and metabolism was probably maximal and not further increasable with this amount of cells suggesting that cell metabolism was already decreased due to cell to cell interaction lowering the proliferation rate of the cells.
In the AlamarBlue assays with 1 000 cells/well, Crescina showed a quite moderate increase of metabolic activity, compared to the negative control, after 4 and 6 h with maximal values of + 14.5 % and + 20.5% respectively, both with 0.5% of Crescina.
Very potent effects were obtained after 24, 48, and 72 h (Figs. 13-14) with maximal increase in the metabolic activity of + 58.5% with 0.125% of Crescina at 24 h, + 111.4% with 0.25% of Crescina at 48 h and + 195.7% with 0.5% of Crescina at 72 h, compared to negative control.
Furthermore, in the AlamarBlue assays determining the Crescina effects on cell proliferation with 5 000 cells/well, Crescina showed an increase in the metabolic activity, compared to non-treated cells (negative control), 4 and 6 h with maximal values of + 33.1% and + 36.5% both with 0.5% of Crescina.
Very potent effects were detected after 24, 48, and 72 h (Figs. 18-19) showing an increase in metabolic activity of + 80.3% with 0.0625% of Crescina at 24 h, + 119.3% with 0.5% of Crescina at 48 h, and + 91.4% with 0.5% of Crescina at 72 h, all of them compared to negative control.
In this way, Crescina increased AlamarBlue reactivity when 5 000 cells were seeded but not as potent as with 1 000 cells per well.
Only slight effects were visible after 24 h, when 10 000 cells where seeded (+ 20.2% with 0.5% of Crescina), and no effects after 48 and 72 h (Fig. 20), suggesting that the proliferation and the viability of cells is not further increasable after later time points. This indicated, that the number of cells is critical for obtaining effects of Crescina and that the number of 10 000 cells is to high to induce cell viability by possible cell to cell interactions occurring in confluent cell layers.

Determination of protein content.
Determination of protein content performed using keratinocytes revealed that, compared to non-treated cells, Crescina increased protein content (+ 160.3%) at the dose of 0.125% of Crescina at 24 h, at the doses of 0.0625% (+ 242.1%) and 0,125% (+ 206.8%) after 48 h and, at least, after 72 h with 0.25% of Crescina it’s possible to notice an increase of protein content of + 73.9% (Fig. 23, 24).
No increase in protein content was visible in fibroblasts after 24 h, but a slight increasing effect after 72 h: + 51.4% with the exposition at 0.125% of Crescina.

Conclusions

Determination of cell proliferation.
Using human keratinocytes, the preparation Crescina had no effects on DNA synthesis as measured by dBrdU incorporation at all tested time points 24, 48 and 72 h.
However, Crescina increased the metabolic activity of cells by increasing cellular energy levels as revealed by the reaction of AlamarBlue.
Using human fibroblasts, Crescina had no effect on DNA synthesis as measured by dBrdU incorporation at all tested time points 24, 48 and 72 h.
In the AlamarBlue assays, very potent effects were obtained after 24, 48, and 72 h with an increase in the metabolic activity compared to non-treated cells .
Our data suggest that due to its positive effects on cell viability and metabolism as shown by the AlamarBlue assays, Crescina should also increase the cell number. Furthermore, we conclude that the treatment with Crescina increases cell life, finally resulting in increased cell numbers, if compared to untreated cells, which have a more rapid cell turnover. This increase in cell numbers in Crescina treated cells, will not increase DNA synthesis as observed in this study.

Determination of protein content.
Determination of protein content in keratinocytes revealed that Crescina increased protein content considerably after 24 h (+ 160.3%) and 48 h (+ 242.1%) compared to negative control.
In fibroblasts, a slight increasing effect was visible after 72 h (+ 51.4%) compared to non-treated cells.
The difference in the total protein content between keratinocytes and fibroblasts is due to the differences in the total cell volume between the epithelial keratinocytes and the smaller fibroblasts.
Therefore, the protein content has not increased in consequence of the pro-proliferative effect of Crescina, but it might be increased due to increased cell viability. This fits to the hypothesis that Crescina promotes cellular metabolism.

Finally, we demonstrated that preparation Crescina increased cell metabolism and therefore might act as a cell protective and energizing hair treatment.

Figures

INFORMACJE ZWROTNE Z RYNKU NA TEMAT SKUTECZNOŚCI CRESCINA

Firma Labo stwierdziła, że należy w swojej polityce reklamowej i marketingowej uwzględniać opinie klientów na rynku - zarówno klientów pierwszego kontaktu – farmaceutów – jak i użytkowników – klientów. W związku z tym zapytała ich o opinie na temat jakości produktu oraz poziomu zadowolenia z produktu. Wyniki ankiety były wyjątkowo pozytywne.

A) Informacje o skuteczności produktu od farmaceutów

Firma Labo zebrała bezpośrednio od farmaceutów ich opinie na temat jakości produktu Crescina oraz zadowolenia klientów. Próba była znacząca: 497 aptek na terenie całego kraju.
Apteki poproszono o wypełnienie, opieczętowanie i podpisanie następującej ankiety: